МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего 
образования «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»

Дзержинский филиал ННГУ	

Д.М. Каморин

ИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Учебно-методическое пособие

Рекомендовано Объединённой методической комиссией Института открытого образования и филиалов университета для обучающихся по дополнительной профессиональной образовательной программе повышения квалификации «Хроматография и наладка хроматографической аппаратуры»

Дзержинск
2018

УДК 543.544
ББК 24.46
	        К18

Ионная хроматография. Автор: Д.М. Каморин. Учебно-методическое пособие. – Дзержинск: Нижегородский госуниверситет, 2018. – с. 28.

Рецензент: к.х.н., доцент кафедры «Химическая технология» ДПИ НГТУ им. Р.Е. Алексеева  С.В. Орехов

Учебно-методическое пособие является кратким руководством по проведению практических работ по определению содержания катионов и анионов в воде методом ионной жидкостной хроматографии. Рассматриваются теоретические основы метода, особенности аппаратурного оформления, постановки эксперимента и эксплуатации хроматографа.
Методические указания предназначены для слушателей групп, изучающих методы жидкостной хроматографии и рассчитаны в первую очередь на начальный уровень подготовки слушателей. Методические указания могут быть использованы лаборантами, инженерами, научными сотрудниками в качестве пособия по проведению ионной хроматографии.

Ответственный за выпуск:
председатель объединенной методической комиссии Института открытого образования и филиалов университета (ОМК) - к.ю.н.  А.К. Балдин

УДК 543.544
ББК 24.46

© Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, 2018

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ   	  4	
1. ТЕОРИЯ ИОНООБМЕННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ	  5	
2. ОСОБЕННОСТИ АППАРАТУРНОГО ОФОРМЛЕНИЯ	  9	
3. СОРБЕНТЫ ДЛЯ ИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ		12	
4. ВЫБОР СОСТАВА ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ	15	
5. ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ СОДЕРЖАНИЯ АНИОНОВ В ВОДЕ	
18	
5.1 АППАРАТУРА И МАТЕРИАЛЫ	18	
5.2 ОПИСАНИЕ РАБОТЫ ДВУХКОЛОНОЧНОГО ИОННОГО ХРОМАТОГРАФА 	
18	
5.3 ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТ	19	
6. ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ СОДЕРЖАНИЯ КАТИОНОВ В ВОДЕ	
23	
6.1 АППАРАТУРА И МАТЕРИАЛЫ	23	
6.2 ОПИСАНИЕ РАБОТЫ ОДНОКОЛОНОЧНОГО ИОННОГО ХРОМАТОГРАФА 	
23	
6.3 ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТ	24	
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ                                                                            	26	
СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ		27	

ВВЕДЕНИЕ

Для анализа содержания органических и неорганических ионных соединений одним из самых универсальных и распространенных методов стала ионная жидкостная хроматография. Ионообменная хроматография представляет собой хроматографический процесс, в котором разделение ионов и полярных молекул происходит ввиду различий в сродстве исследуемых веществ к ионообменнику. Ионообменная хроматография работает практически с любым видом заряженных молекул, включая белки, нуклеотиды и аминокислоты. Двумя типами ионной хроматографии являются анионообменная и катионообменная хроматография. Катионообменный вариант используется, когда анализируемые вещества являются катионами, а анионообменная хроматография используется для разделения анионов. 
Ионная хроматография нашла широкое применение в медицине, биологии, биохимии, для контроля состояния окружающей среды, в промышленности и научно-исследовательских лабораториях. 
Развитие теоретических основ метода, разработка высокоэффективных ионообменных сорбентов, а также достижения в области аппаратурного обеспечения и методологических аспектов проведения процесса позволили методу ионной хроматографии стать одним из наиболее распространенных методов жидкостной хроматографии, обеспечивающим возможность определять очень большое число неорганических и органических ионов. Метод демонстрирует высокую чувствительность, селективность, производительность, а также широкий диапазон определяемых концентраций ионных соединений. С учетом приемлемых стоимостных характеристик и доступности метода ионная хроматография является оптимальным решением для анализа ионных соединений, а в некоторых случаях и единственным на данный момент выбором. 

1. ТЕОРИЯ ИОНООБМЕННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Хроматография – это метод разделения смесей веществ или частиц, основанный на различии в скоростях их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз. Неподвижной (стационарной) фазой  служит твердое  пористое  вещество (часто  его  называют  сорбентом)  или  пленка жидкости, нанесенная на твердое вещество или стенки колонки. Подвижная фаза представляет собой жидкость  или  газ,  протекающий  через  неподвижную  фазу. В случае использования в качестве подвижной фазы жидкости хроматографию называют жидкостной.  Существует несколько классифицирующих признаков для жидкостной хроматографии, из числа которых одним из наиболее важных является классификация по механизму разделения веществ. В соответствии с природой основного процесса разделения жидкостную хроматографию делят на адсорбционную (разделение основано на явлении адсорбции), распределительную (экстракция), эксклюзионную (диффузия) и ряд других видов хроматографии. Также одним из важнейших методов жидкостной хроматографии является ионообменная хроматография, механизм разделения в которой связан с электростатическим взаимодействием разделяемых веществ с заряженными группами стационарной фазы.
	Удерживание в ионообменной хроматографии возникает из-за электростатических взаимодействий между ионами в подвижной фазе и противоположно заряженных ионных функциональных групп, иммобилизованных на поверхности твердого носителя. Сорбенты в ионообменной хроматографии делятся на анионообменники и катионообменники в зависимости от характера функциональных групп, входящих в состав   неподвижной фазы. На поверхности анионообменного твердого сорбента находятся иммобилизированные катионные группы, способные удерживать соединения с противоположенным зарядом, то есть анионы. Обратная ситуация наблюдается в случае катионообменных сорбентов, которые несут отрицательно заряженные функциональные группы и вступают во взаимодействия с катионами, находящимися в подвижной фазе.   
	Вокруг заряженных групп сорбента находятся противоположно заряженные ионы подвижной фазы, называемые противоионами,  которые способны к ионному обмену и обеспечивающие сохранение электронейтральности сорбента. Ион исследуемого образца при взаимодействии с заряженной группой сорбента замещает противоион. Таким образом, при хроматографическом разделении ионы определяемого компонента соперничают с ионами, находящимися в мобильной фазе, за взаимодействие с противоположно заряженными функциональными группами стационарной фазы. 

Ионный обмен можно представить в виде следующих уравнений 1 и 2:                         
катионный обмен 
R-X- C+ + M+ B- ↔ R-X- M+ + C+ + B-		(1)
анионный обмен 
R-X+ A- + M+ B- ↔ R-X+ B- + M+ + A-		(2)
где R - поверхность сорбента с иммобилизированным ионом X- или X+,
       C+ и A- - ионы подвижной фазы,
       M+ и B- - ионы образца.
Разделение компонентов анализируемой пробы в ионной хроматографии происходит благодаря обратимому электростатическому взаимодействию ионогенных соединений с заряженными функциональными  группами сорбента. Мобильная фаза содержит противоионы, и ионные молекулы образца конкурируют с ними за места на поверхности неподвижной фазы, способной к ионному обмену и имеющей электрические заряды на своей поверхности.  В случае катионного обмена ион образца M+ замещает собой противоион С+ и вступает в электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженной группой катионообменника X-, что приводит к удерживанию ионного соединения M+ (рис. 1). 

Рисунок 1. Ионообменное хроматографическое разделение.	
При этом ионы образца, слабо взаимодействующие с ионными группами сорбента, будут слабо удерживаться на колонке и, соответственно, первыми выходить из нее. И наоборот, сильно удерживаемые ионы с высоким сродством к заряженным группам неподвижной фазы будут выходить из колонки в последнюю очередь. Неионогенные соединения и вещества (B-) того же заряда, что и иммобилизированные на сорбенте группы, не вступают в электростатическое взаимодействие со стационарной фазой и не удерживаются в хроматографической колонке. Поэтому на выходе из колонки первыми будут неудерживаемые ионы B-, после которых будет выходить хроматографический пик удерживаемого катионообменной колонкой иона M+. Аналогичные процессы происходят на анионообменнике с разницей лишь в знаках зарядов ионов, и в соответствии с уравнением 2 в конкуренцию с ионами мобильной фазы A- в данном случае вступают анионы образца B-.
Как и в случае других видов жидкостной хроматографии процесс разделения по ионообменному механизму осложнен протеканием вторичных взаимодействий. Чаще всего это взаимодействия неионной природы, такие как адсорбция или образование водородных связей между молекулами образца и сорбентом. Зачастую сложно выделить «классическую» ионообменную хроматографию в «чистом» виде. Поэтому некоторые хроматографисты исходят из эмпирических закономерностей, а не из теоретических законов для подбора условий разделения и предсказания времен удерживания и порядка выхода компонентов при ионообменной хроматографии.
Для обеспечения оптимальных условий процесса разделения и регулирования конкуренции между ионами подвижной фазы и анализируемых веществ аналитик должен тщательно выбирать такие составляющие метода, как: 
(а) тип ионообменника, 
(б) рН подвижной фазы, 
(в) ионную силу подвижной фазы, 
(г) тип противоиона в подвижной фазе 
и при необходимости изменять любой или все из них. Этот процесс оптимизации зачастую носит эмпирический характер, хотя некоторые закономерности, безусловно, соблюдаются. 
Таким образом, удерживание в ионообменной хроматографии определяется величиной рН подвижной фазы, ионной силой, характером и концентрацией буферных ионов в подвижной фазе. Органические модификаторы, такие как метанол, ацетонитрил или тетрагидрофуран, также могут быть добавлены к подвижной фазе, поскольку удерживание гидрофобных ионов может также возникать в результате взаимодействия с гидрофобными фрагментами стационарной фазы или углеводородной функциональной группой, связывающей ионообменную группу с носителем. 

Конкуренция ионов в подвижной фазе с адсорбированными противоионами на стационарной фазе определяется уравнениями 1 и 2 для катионитов и анионитов соответственно, и, исходя из этих уравнений для моновалентных ионов A и B, находящихся на поверхности сорбента (As, Bs) или в мобильной фазе (Am, Bm), константу ионного обмена можно записать как:
	
(3)
	
Константу ионного обмена иногда называют константой селективности ионного обмена, так как она выражает относительное сродство ионообменника к двум ионам. Таким образом, константа ионного обмена составляет основу элюотропного ряда противоионов, которая может быть использована при разработке ионообменного метода. Сродство иона к заряженной функциональной группе ионообменника зависит от заряда и радиуса иона. Удерживание увеличивается с увеличением заряда и уменьшением размера гидратированного иона растворенного вещества, но для ионов с равным зарядом растворы солей лития являются самыми слабыми растворителями на сильных катионитах, а растворы фторидных солей являются самыми слабыми растворителями на сильных анионитах. Порядок сродства ионов для сильных ионитов может быть применен и к слабым ионитам со следующими исключениями: ион водорода имеет самое сильное сродство среди всех катионов для слабых катионитов, а гидроксид-ион имеет самое сильное сродство среди всех анионов для слабых анионитов.
Ряды противоионов в порядке убывающей активности и уменьшения сродства к ионообменной смоле имеют вид: 
 
для сильных анионов 
HSO4- > СlO3- > NО3- > Вг- > CN- > НСО3- > ОАс - > ОН- > F- 

для сильных катионов  
Ва2+ > Рb2+ > Са2+ > Ni2+ > Cd2+ > Co2+ > Zn2+ > Mg2+ > Ag+ > Cs+ >   Rb+> K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li+

Константа ионного обмена также определяет порядок элюирования в ряду ионных веществ. 
На основе уравнения 3 может быть получено уравнение 4, которое связывает отношение фактора емкости компонента А с константой ионного обмена для пары ионов A и B и концентрациями противоиона в подвижной фазе ([B]s) и стационарной фазе ([B]m)

           (4)	
При условии [B]s >> [A]s, концентрация противоионов в стационарной фазе будет равна концентрации ионообменных групп в сорбенте - Q. Эта концентрация определяется как ионообменная емкость стационарной фазы, и тогда фактор емкости для иона А будет равен:

	
                (5)	
	
                (6)	

Уравнения 5 и 6 предсказывают, что удерживание в ионообменной хроматографии уменьшается с увеличением концентрации противоионов в подвижной фазе. Таким образом, удерживание оптимизируется путем соответствующего выбора типа и концентрации электролитов, добавленных в подвижную фазу.
Константа ионного обмена изменяется от одной пары ионов к другой, поэтому селективность можно контролировать выбором противоиона. Однако селективностью удобнее манипулировать путем регулирования рН подвижной фазы и использования различий в значениях константы распределения анализируемых веществ, подлежащих разделению. В отличие от жидкостной хроматографии с обращенной фазой удерживание слабых кислот и слабых оснований достигнет максимума когда соединения находятся в их ионизованных формах. Цвиттер-ионные соединения (молекулы которых несут как отрицательный, так и положительный заряд), такие как аминокислоты, пептиды и белки, при этом могут быть разделены на анионитах или катионитах.
Способность ионообменников разделять ионы разного заряда высока, и разделение ионов разных зарядов для сокращения времени анализа обычно проводится в условиях градиентного элюирования. Градиент растворителя может быть получен в ионообменной хроматографии путем непрерывного увеличения концентрации данного противоиона или поэтапно путем резкого изменения рН, природы противоиона или его концентрации в подвижной фазе.
2. ОСОБЕННОСТИ АППАРАТУРНОГО ОФОРМЛЕНИЯ

Как было сказано выше, ионообменная хроматография является одним из вариантов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), в котором разделение происходит благодаря электростатическому (кулоновскому) взаимодействию между компонентами пробы и сорбентом. Таким образом, являясь одним из вариантов ВЭЖХ, ионообменная хроматография в общем случае в техническом плане мало чем отличается от других видов ВЭЖХ. Как и в остальных случаях для проведения высокоэффективного хроматографического разделения обязательным будет наличие насоса высокого давления, узла ввода пробы, хроматографической колонки с соответствующим сорбентом, а также детектора, связанного с устройством регистрации сигнала (компьютером). Также как и в других видах ВЭЖХ данный минимальный набор может быть дополнен многими вспомогательными блоками и узлами, способствующими повышению точности и воспроизводимости анализа, сокращению его продолжительности, повышению автоматизации процесса и  решению других задач оптимизации хроматографического процесса.
Но у метода есть и некоторые особенности. И главная из них связана с наиболее распространенным при ионообменной хроматографии типом детектора - кондуктометрическим детектором. Важность данного метода детектирования такова, что вариант  ионообменной  хроматографии,  предусматривающий кондуктометрическое определение концентрации анализируемых ионов, первоначально получил отдельное название - ионная  хроматография. Сейчас же термин ионная хроматография используется для обозначения всех высокоэффективных ионообменных хроматографических методов разделения с автоматическим детектированием.  
Использование кондуктометрического детектора, оценивающего электрическую проводимость поступающей в него жидкости, требует низкой электропроводности мобильной фазы, что вступает в противоречие с требованиями, предъявляемыми к составу мобильной фазы с точки зрения успешного разделения анализируемых компонентов, а именно с условием относительно высокого содержания электролитов. Для разрешения данной проблемы используются два метода. 
Первый из них был предложен в 1975 г. Х. Смолом, Т. Стивенсом и В. Бауманом. Метод предполагает компенсацию (также используется термин "подавление")  электролита с помощью дополнительной ионообменной  колонки. Функция компенсационной (или подавительной) колонки состоит в том, чтобы удалить бо́льшую часть ионов элюента. Подавительную колонку располагают между аналитической разделяющей колонкой и кондуктометрическим детектором. Таким образом, хроматографическое разделение в аналитической колонке протекает при требуемом для задач разделения компонентов пробы высоком содержании электролитов в элюенте, а в детектор элюент поступает уже после подавления электропроводности с требуемым для детектирования пониженным содержанием электролитов. 
Подавительная система,  предназначенная для обеспечения максимального различия кондуктометрических сигналов элюента и определяемого иона, является составной частью системы  детектирования. В общем виде схема хроматографического комплекса с колоночным подавлением электропроводности элюента имеет вид, представленный на рис. 2.  

Рисунок  2.  Схема ионного хроматографа с колоночным подавлением элюента.	

В состав комплекса входят: 
1 - емкость для подачи элюента;
2 - фильтр мобильной фазы;
3 - насос;
4 - инжектор;
5 – аналитическая ионообменная колонка низкой емкости;
6 – подавительная ионообменная колонка высокой емкости;
7 – кондуктометрический детектор;
8 - емкость для приема элюента;
9 -  компьютер.
Подавительная колонка представляет собой ионообменник с  высокой  емкостью, что обусловлено необходимостью увеличения времени между регенирациями подавительной колонки, которое напрямую связано с емкостью колонки. В  процессе  работы  первоначально находящиеся в колонке противоионы постепенно замещаются на ионы мобильной фазы до полной замены одних ионов другими. Отработанная таким образом колонка перестает  подавлять  фон  элюента  и  ее  необходимо  регенерировать. 
При анионообменной хроматографии подавляющую колонку заполняют катионообменником высокой емкости в Н-форме, а в случае определения  катионов колонку  заполняют  анионообменником высокой емкости в ОН-форме.
Применение подавительных колонок было первым и в течение некоторого времени единственным решением проблемы высокой электропроводности элюента. Кроме того, данный подход является самым дешевым способом подавления электропроводности элюента, поэтому он массово использовался на протяжении нескольких десятилетий для проведения ионной хроматографии. 
	В настоящее время широкое распространение находят мембранные системы подавления. Принцип  действия мембранной  системы  подавления заключается в том, что элюент  и определяемые ионы направляются после разделяющей колонки внутрь тонкой трубки, стенки которой изготовлены из полупроницаемого ионообменного материала. Мембранная  трубка погружена в  регенерирующий раствор. Через стенки трубки происходит обмен ионов, приводящий к подавлению элюента. При этом полунепроницаемый материал трубки не позволяет ионам регенерата, элюента и анализируемого образца проникать через стенку трубки. Такая система подавления позволяет устранить недостатки, связанные с необходимостью частой регенерации и большим мертвым объемом подавляющей колонки.
Второй метод ионной хроматографии предполагает использование в качестве элюента раствор электролита с низкой электропроводностью и ионообменную разделяющую колонку низкой емкости. Подавительная колонка в этом случае не требуется, и кондуктометрический детектор присоединяют непосредственно к аналитической  колонке. Этот метод проведения  ионной  хроматографии  назван одноколоночной ионной хроматографией. Снижение обменной емкости разделительной ионообменной колонки позволяет использовать элюенты с более низким содержанием электролитов по сравнению с двухколоночным вариантом. Сами электролиты выбираются из числа соединений с высоким сродством к ионообменному сорбенту и низкой электропроводностью. Примером этого может служить использование карбоновых кислот при разделении катионов. Все эти мероприятия позволяют достигнуть существенного снижения фоновой электропроводности элюента, которая не может помешать кондуктометрическому определению содержания интересующих компонентов пробы. Кроме того, при одноколоночной ионной хроматографии можно использовать не только кондуктометрический, но и другие детекторы (например, спектрофотометрический детектор). В этом случае специальные требования к составу элюента и к обменной емкости ионообменной колонки, предъявляемые в одноколоночном варианте с кондуктометрическим детектированием, снимаются.

3. СОРБЕНТЫ ДЛЯ ИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Как было отмечено выше, успешное разделение конкретных веществ в большой степени зависит от выбора наиболее подходящего сорбента и состава мобильной фазы. Удерживание в ионообменной хроматографии возникает из-за электростатических взаимодействий между ионами подвижной фазы и противоположно заряженных ионных функциональных групп, иммобилизованных на поверхности твердого носителя. Природа ионогенных групп сорбента определяет степень их взаимодействия с ионами, находящимися в мобильной фазе, а также возможность управления удерживанием путем изменения pH элюента.
Ионообменные сорбенты в зависимости от характера функциональных групп на поверхности неподвижной фазы делят на аниониты, на которых удерживаются анионы, и катиониты, используемые для разделения катионов. Помимо этого анионные и катионные ионообменники классифицируются на слабые и сильные в соответствии со значением константы диссоциации иммобилизованной функциональной группы.
Обычно сильные аниониты (SAX) являются иммобилизированными ионами аммониевых солей, а сильные катиониты (SCX) являются иммобилизированными сульфокислотами. Все сильные ионообменники пребывают в ионизированной форме во всем диапазоне рН, используемом в ВЭЖХ. Слабыми анионообменниками (WAX) являются аминные группы, а слабые катионообменники (WCX) - иммобилизированные карбоновые кислоты. Все они пребывают в ионизированной форме только при определенных значениях рН мобильной фазы.
Так как сильные ионообменники заряжены во всем рабочем диапазоне рН, который используется в ВЭЖХ, их емкость не может быть изменена путем изменения рН элюента. Они используются для отделения слабых кислот или оснований, а параметром, определяющим удерживание, является заряд аналитов, которые меняют степень ионизации в зависимости от рН среды. Однако, если молекулы образца являются сильными кислотами или основаниями, то их поведение слабо зависит от изменений рН подвижной фазы, поскольку они также полностью ионизированы в очень широком диапазоне значений pH. 
При экстремальных значениях рН сильные катиониты находятся в неионизированной форме (при pH < 2), для сильных анионитов это состояние наступает в основной среде (при pH>10). В этих случаях могут катализироваться многочисленные реакции, способные привести к химическим превращениям образца.
Ионообменная емкость (а значит и удерживание) для слабых ионообменников зависит от рН подвижной фазы. Слабый катионообменник не диссоциирует, если рН заметно ниже (примерно на 2 единицы рН), чем его значение pKa. При таком значении рН ионообменник находится в своей водородной форме, причем протоны настолько сильно связаны с функциональными группами сорбента, что их замена катионами образца становиться невозможной, и обменная емкость катионообменника в этом случае близка к нулю. Однако катионообменник полностью диссоциирован, если рН заметно превышает значение pKa, и его ионные группы способны взаимодействовать с молекулами образца при максимальной обменной емкости. При значении рН, близком к значению pKa, слабый катионообменник только частично диссоциирует, и обменная емкость, а значит и удерживание, могут быть заданы с помощью pH среды. Аналогичные принципы справедливы и для слабых анионитов, но их емкость высока при низких значениях рН и низка при высоком значении водородного показателя. Зависимость обменной емкости слабых ионообменников как функции рН элюента показана на рис. 3. Следует отметить, что чем выше будет обменная емкость ионообменника, тем сильнее будет удерживание компонентов пробы, способных к ионному обмену.

Рисунок 3. Зависимости обменной емкости слабых катионообменников (а) и анионообменников (б) от рН мобильной фазы [2].	

В качестве неподвижных фаз в ионообменной хроматографии применяют силикагели с привитыми ионогенными группами и ионообменные полимерные смолы. 
Традиционно большой интерес в качестве сорбентов для ионообменной хроматографии представляет химически модифицированный силикагель, получаемый прививкой к силикагелю ионогенных групп. Применение этих материалов значительно увеличивает стабильность работы колонок, в которых не происходит изменения эффективности. Однако сильнокислые (pH<2) или основные среды (рН>7,5) могут воздействовать на силикагель, разрушая его и выводя из строя колонку. Кроме того, ионообменники с привитыми к силикагелю ионообменными группами могут быть нестабильны при действии органических растворителей, концентрированных буферных растворов и повышенных температур. При этом преимуществами носителей на основе диоксида кремния является их высокая механическая прочность и стойкость к высоким давлениям по сравнению с материалами на основе полимеров.
	В настоящее время большое распространение получили ионообменные полимерные материалы, чаще всего представляющие собой сополимеры стирола и дивинилбензола с привитыми ионообменными группами. По сравнению с ионообменными сорбентами на основе силикагеля полимерные сорбенты имеют меньшую механическую стойкость и меньшие допустимые рабочие давления. С другой стороны, основным преимуществом стационарных фаз на основе полимеров является их устойчивость к химическому воздействию в широком диапазоне значениях рН мобильной фазы. 

4. ВЫБОР СОСТАВА ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ

	Как и в большинстве методов ВЭЖХ функции подвижной фазы в ионной хроматографии весьма разнообразны. В первую очередь элюент должен выполнять транспортную функцию и обеспечивать движение компонентов пробы по хроматографическому тракту. Для этого обязательным требованием, предъявляемым к элюенту, является способность растворять анализируемые вещества. Важная функция мобильной фазы в ионной хроматографии состоит в регулировании удерживания и селективности. Основными инструментами для управления этими характеристиками хроматографического процесса являются ионная сила элюента (концентрация электролитов) и значение pH мобильной фазы. Еще одной функцией выступает подавление нежелательных вторичных взаимодействий между компонентами пробы и матрицей ионообменного сорбента, для чего в элюент обычно вводят некоторое количество органического модификатора (метанол, этанол, ацетонитрил, тетрагидрофуран). Добавлением органических растворителей можно добиться также изменения селективности системы. Кроме того, в случае ионной хроматографии с использованием кондуктометрического детектирования элюент должен не препятствовать определению содержания компонентов пробы и, в случае одноколоночного варианта, иметь достаточно низкую электропроводность, или, при двухколоночном варианте, образовывать в подавительной колонке малодиссоциирующие соединения с низкой электропроводимостью.
В качестве подвижной фазы используют водные растворы солей, кислот или оснований, то есть системы растворителей, имеющих высокое значение  диэлектрической проницаемости. Сила и селективность растворителя зависят от типа и концентрации ионов мобильной фазы, от значения рН и от вида и концентрации добавленных органических растворителей. 
	В двухколоночной анионообменной хроматографии распространенными элюентами являются разбавленные растворы солей слабых кислот (табл. 1). Применяемые элюенты делят по силе и придерживаются такого выбора состава элюента, чтобы сорбционная способность элюирующего иона несколько превышала таковую для наиболее прочно удерживаемого компонента пробы.

Таблица 1. Элюенты, применяемые в двухколоночной анионной хроматографии [5].	

	Элюенты,  содержащие  тетраборат  натрия,  обладают  очень  низкой  способностью  к вытеснению и применяются  редко. Однако  они полезны  в  случае  разделения  быстроэлюируимых частиц, таких, как фторид, формиат и ацетат. Борат натрия в результате конверсии в компенсационной колонке дает слабодиссоциирующую борную кислоту. Элюент, содержащий гидроксид натрия, с точки зрения компенсации фонового сигнала является идеальным, поскольку он конвертируется в воду. Недостатком же этого элюента является его низкое сродство к разделяющей смоле, что обеспечивает вытеснение только слабоудерживаемых анионов. Увеличение концентрации  гидроксида натрия в растворе увеличивает его способность к вытеснению, но вызывает быструю отработку подавительной колонки. Гидроксид натрия иногда добавляют к некоторым элюентам, таким, как растворы бикарбоната и карбоната натрия. Карбонат имеет очень хорошие элюирующие свойства, и его можно использовать в сравнительно низких концентрациях. Чаще всего применяются  элюенты, которые представляют собой буферные растворы, приготовленные смешением карбоната и бикарбоната. Селективность такого элюента можно легко изменить за счет соотношения компонентов,  то есть меняя  значение рН  элюента. Кроме  того,  чтобы  обеспечить  быстрое или  медленное  элюирование,  не  влияя  на  порядок  выхода  анализируемых  ионов,  можно просто изменить ионную силу элюента.
	В случае анионной одноколоночной хроматографии количество возможных элюирующих систем с различными химическими характеристиками практически неограниченно. Помимо самой задачи разделения необходимо учитывать совместимость элюента с детектором. Например, если необходимо использовать прямое УФ-детектирование, то элюент не должен поглощать в соответствующем спектральном диапазоне. Для одноколоночного варианта ионной хроматографии по системе детектирования не установлены ограничения и в принципе можно использовать все обычные ВЭЖХ-детекторы. Для малоемкостных анионитов для одноколоночного метода доступен целый ряд элюентов с различными химическими характеристиками. В качестве мобильной фазы могут использоваться водные растворы таких соединений, как ароматические карбоновые кислоты, алифатические карбоновые кислоты, сульфокислоты и др.
	Ароматические карбоновые кислоты используется очень широко, так как растворы кислот и их солей обладают очень высокой элюирующей способностью в сочетании с относительно небольшой проводимостью, поэтому их можно использовать для прямого кондуктометрического детектирования. При использовании многоосновных кислот заряд и, следовательно, силу элюирования можно контролировать с помощью рН. Ароматические карбоновые кислоты имеют высокое поглощение в УФ спектре, так что их можно использовать преимущественно при косвенном обнаружении в УФ области.
	Алифатические карбоновые кислоты, такие как щавелевая кислота и лимонная кислота, обладают высокой проводимостью, но являются прозрачными в ультрафиолетовой области спектра, поэтому их можно использовать для прямого обнаружения в УФ.
	Если используются неорганические кислоты или их соли, то их практически полная диссоциация и связанная с ней высокая проводимость означают, что могут использоваться только фотометрические детекторы.
	В случае двухколоночной катионной ионообменной хроматографии для разделения однозарядных катионов  используются элюенты с низкой элюирующей силой, и эффективными элюентами в этом случае являются разбавленные растворы минеральных кислот (например, азотной). Двухзарядные  катионы (например, щелочноземельных металлов)  значительно  сильнее удерживаются на катионообменной смоле, и их уже нельзя вымывать  элюентами, пригодными для разделения однозарядных ионов. Несмотря на  то,  что  увеличение  концентрации  минеральных  кислот  приводит  к  увеличению  вытеснительной  способности  элюента, концентрированные элюенты обладают более высокой коррозионной активностью и вызывают преждевременное истощение подавительной колонки. Таким образом, для разделения двухзарядных  катионов целесообразнее применять  элюенты  с  более  высокой  вытеснительной способностью. К элюентам со средней элюирующей силой можно отнести растворы солей некоторых среднеудерживаемых моноаминов, диаминов и аминокислот. К сильным элюентам относятся растворы двухзарядных катионов этилендиамина, фенилендиамина, диаминопропионовой кислоты и др.
	При определении катионов щелочных металлов и аммония способом одноколоночной ионной хроматографии, как правило, используют разбавленные растворы азотной или соляной кислот. 

5. ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ СОДЕРЖАНИЯ АНИОНОВ В ВОДЕ

Цель работы: ознакомление с работой жидкостного хроматографа в режиме двухколоночной хроматографии и методикой проведения хроматографического определения содержания анионов в воде.
Задачами работы являются:
- ознакомление с конструкцией двухколоночного ионного хроматографа,
- приобретение навыков работы на приборе,
- построение калибровочных зависимостей по выбранным анионам, 
- хроматографическое определение содержания анионов в образцах. 

5.1 АППАРАТУРА И МАТЕРИАЛЫ
1. Хроматограф жидкостной Хромос ЖХ 301. В его составе: 
- насос высокого давления ECP2000 (ECOM);
- кран-дозатор TYPE D (ECOM), объем петли - 20 мкл;
- анионообменная колонка «Аниекс» с диаметром частиц 20 мкм и размерами 100×6 мм;
- подавительная система с полупроницаемой мембраной;
- кондуктометрический детектор КД-1;
- аналогово-цифровой преобразователь;
- компьютер с программным обеспечением «Хромос»; 
2. Виалы объемом 10 мл;
3. Свежеподготовленный элюент: 
- водный раствор гидрокарбоната (2 ммоль/л) и карбоната натрия (2 ммоль/л);
4. Весы аналитические;
5. Фильтрующие насадки на шприц с размером пор 0,45 мкм;
6. Шприцы медицинские одноразовые объемом 10 мл;
7. Шприц хроматографический объемом 100 мкл;
8. Колбы мерные, 1 л.

5.2 ОПИСАНИЕ РАБОТЫ ДВУХКОЛОНОЧНОГО ИОННОГО ХРОМАТОГРАФА 

	Элюент (водный раствор гидрокарбоната и карбоната натрия - по 2 ммоль/л) из емкости для подачи элюента изократическим насосом ECP2000 направляется со скоростью потока 1.5 мл/мин в кран-дозатор TYPE D (ECOM) с объемом петли 20 мкл и ручкой переключения потоков, находящейся в положении «LOAD». Ввод пробы осуществляется хроматографическим шприцем в объеме 100 мкл. После этого ручка переключения потоков инжектора переводится в положение «INJECT». В результате поток элюента направляется через заполненную анализируемой смесью петлю, и одновременно с этим начинается запись хроматограммы. Из инжектора мобильная фаза с пробой поступает в аналитическую анионообменную колонку, в которой происходит разделение компонентов пробы, и далее в подавительную систему с полупроницаемой мембраной, погруженный в раствор серной кислоты. Система подавления обеспечивающую снижение электропроводности элюента. Выходящая из подавительной системы подвижная фаза поступает в кондуктометрический детектор КД-1. По показаниям детектора, передаваемым через аналогово-цифровой преобразователь, ведется запись хроматограммы на компьютере. После детектора подвижная фаза поступает в емкость для приема элюента. 

5.3 ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТ

5.3.1 Приготовление калибровочных растворов для выбранных анионов с концентрацией 20-100 мг/л в воде.
 Для этого на аналитических весах взвешивают рассчитанное количество соответствующей соли и записывают массу навески с точностью до четвертого знака после запятой. Затем навеску переносят в мерную колбу объемом 1 литр, добавляют воду для растворения соли, а после этого доводят объем раствора до метки. Рассчитывают концентрацию аниона в калибровочном растворе. 
Часть полученного раствора отбирают медицинским шприцем, устанавливают на щприц фильтрующую насадку (рис. 4) и производят фильтрацию раствора в виалу.

Рис. 4. Хроматографический шприц (вверху) и медицинский шприц с установленной фильтрующей насадкой (внизу). 

5.3.2. Включение хроматографа.
Свежеподготовленную мобильную фазу помещают в емкость для подачи элюента. Включают электропитание насоса и детектора. Устанавливают расход элюента равный 1,5 мл/мин. Для этого на панели управления насосом (рис. 5) нажимают клавишу «FUNC» и, тем самым, переходят в режим установки расхода подвижной фазы (надпись «FLou» на дисплее насоса). Затем клавишами «Вверх» (˄) и «Вниз» (˅) устанавливают требуемый расход и нажимают клавишу «START-STOP-ENTER». Убедившись в том, что на выходе элюента из детектора установлена емкость для приема, включают подачу подвижной фазы  клавишей «START-STOP-ENTER». 

Рис. 5. Панель управления насосом.

Проводят проверку поступления элюента в емкость для приема, отсутствие утечек, стабильность расхода элюента и рабочего давления по показаниям насоса.
На компьютере в программе «Хромос» производят подключение прибора нажатием значка «Подключить/отключить прибор 1» на верхней панели программы (рис. 6, значок 1).

Рис. 6. Окно программы "Хромос".

5.3.3. Получение хроматограмм для калибровочных растворов.
В хроматографический шприц отбирают калибровочный раствор в объеме 100 мкл из виалы. Ручка переключения потоков инжектора устанавливается в положение «LOAD» (рис. 7). С помощью шприца производится загрузка образца в петлю инжектора. Ручка переключения потоков инжектора переводится в положение «INJECT». Одновременно с этим автоматически начинается запись хроматограммы. Пример хроматограммы при разделении иона хлора и фосфат-иона представлен на рис. 8.  Время анализа составляет 15 мин.

Рис. 7. Инжектор в положении LOAD.

По завершении анализа в паспорте хроматограммы (вызов диалогового окна осуществляется нажатием значка на верхней панели программы, рис. 6, значок 2) указывается название пробы и устанавливается флажок «Градуировочная» (рис. 9). Далее, разметив пик аниона, в окне хроматограммы вводят название пробы в графе «Компонент» и вводят в графе «Концентрация» значение содержания аниона в калибровочном растворе. Далее добавляют хроматограмму в калибровочную зависимость с использованием метода расчета - абсолютная градуировка. 

Рисунок 8. Хроматограмма разделения хлорид- и фосфат-ионов	

Градуировку выполняют по 4 приготовленным водным растворам с известной концентрацией аниона. В процессе градуировки хроматографа проводят построение градуировочной зависимости вида  Si = f (Сi),  где Si — площади (или высоты) пиков аниона на хроматограмме; Ci — концентрации аниона в градуировочных растворах.

Рис. 9. Окно паспорта хроматограммы

5.3.4. Получение хроматограммы исследуемого образца.
Получают у преподавателя контрольный водный раствор, хроматографируют его не менее трех раз. В хроматографический шприц отбирается раствор контрольного образца из виалы в объеме 100 мкл. Ручка переключения потоков инжектора устанавливается в положение «LOAD». С помощью шприца производится загрузка образца в петлю инжектора. Ручка переключения потоков инжектора переводится в положение «INJECT». Одновременно с этим автоматически начинается запись хроматограммы. Время анализа 15 мин.
По завершении анализа в паспорте хроматограммы указывают название пробы. Флажок «Градуировочная» не устанавливают. Проводят разметку пика аниона в окне хроматограммы.
Результат  измерений  – концентрация аниона в проанализированном  контрольном образце  (Сизм)  автоматически рассчитывается программной  системой сбора и обработки хроматографической информации «Хромос»,  используя полученный градуировочный график. Получив у преподавателя  сведения о концентрации аниона в растворе (Сист), рассчитывают  относительную погрешность анализа по выражению: 
			Δс=100[Сизм – Сист]/Сист 		(7)

6. ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ СОДЕРЖАНИЯ КАТИОНОВ В ВОДЕ 

Цель работы: ознакомление с работой жидкостного хроматографа в режиме одноколоночной хроматографии и методикой проведения хроматографического определения содержания катионов в воде.
Задачами работы являются:
- ознакомление с конструкцией одноколоночного ионного хроматографа,
- приобретение навыков работы на приборе,
- построение калибровочных зависимостей по выбранным катионам, 
- хроматографическое определение содержания катионов в образцах. 

6.1 АППАРАТУРА И МАТЕРИАЛЫ
1. Хроматограф жидкостной Хромос ЖХ 301. В его составе: 
- насос высокого давления ECP2000 (ECOM);
- кран-дозатор TYPE D (ECOM), объем петли - 20 мкл;
- катионообменная колонка Reprosil 100 Cat с диаметром частиц 5 мкм и размерами 125×4.6 мм;
- кондуктометрический детектор КД-1;
- аналогово-цифровой преобразователь;
- компьютер с программным обеспечением «Хромос»; 
2. Виалы объемом 10 мл;
3. Свежеподготовленный элюент: 
- водный раствор аскорбиновой (0.6 ммоль/л) и щавелевой (1.5 ммоль/л) кислот;
4. Весы аналитические;
5. Фильтрующие насадки на шприц с размером пор 0,45 мкм;
6. Шприцы медицинские одноразовые объемом 10 мл;
7. Шприц хроматографический объемом 100 мкл.

6.2 ОПИСАНИЕ РАБОТЫ ОДНОКОЛОНОЧНОГО ИОННОГО ХРОМАТОГРАФА 

	Элюент (водный раствор аскорбиновой и щавелевой кислот) из емкости для подачи элюента изократическим насосом ECP2000 направляется со скоростью потока 1,5 мл/мин в находящейся в положении «LOAD» кран-дозатор TYPE D (ECOM) с объемом петли 20 мкл. Ввод пробы осуществляется хроматографическим шприцем в объеме 100 мкл. После этого ручку переключения потоков инжектора переводят в положение «INJECT». В результате поток элюента направляется через заполненную анализируемой смесью петлю, и одновременно с этим начинается запись хроматограммы. Из инжектора мобильная фаза с пробой поступает в аналитическую катионообменную колонку, в которой происходит разделение компонентов пробы. Выходящая из аналитической колонки подвижная фаза поступает в кондуктометрический детектор КД-1. По показаниям детектора, передаваемым через аналогово-цифровой преобразователь, ведется запись хроматограммы на компьютере. После детектора подвижная фаза поступает в емкость для приема элюента. 

6.3 ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТ

6.3.1 Приготовление калибровочных растворов для выбранных катионов с концентрацией 20-100 мг/л в воде.
На аналитических весах взвешивают рассчитанное количество соответствующей соли и записывают массу навески с точностью до четвертого знака после запятой. Затем навеску переносят в мерную колбу объемом 1 литр, добавляют воду для растворения соли, а после этого доводят объем раствора до метки. Рассчитывают концентрацию катиона в калибровочном растворе.
Часть полученного раствора отбирают медицинским шприцем, устанавливают на щприц фильтрующую насадку (рис. 4) и производят фильтрацию раствора в виалу.

6.3.2. Включение хроматографа.
Свежеподготовленную мобильную фазу помещают в емкость для подачи элюента. Включают электропитание насоса и детектора. Устанавливают расход элюента равный 1,5 мл/мин. Для этого на панели управления насосом (рис. 5) нажимают клавишу «FUNC» и, тем самым, переходят в режим установки расхода подвижной фазы (надпись «FLou» на дисплее насоса). Затем клавишами «Вверх» (˄) и «Вниз» (˅) устанавливают требуемый расход и нажимают клавишу «START-STOP-ENTER». Убедившись в том, что на выходе элюента из детектора установлена емкость для приема, включают подачу подвижной фазы  клавишей «START-STOP-ENTER». 
Проводят проверку поступления элюента в емкость для приема, отсутствие утечек, стабильность расхода элюента и рабочего давления по показаниям насоса.
На компьютере в программе «Хромос» производят подключение прибора нажатием значка «Подключить/отключить прибор 1» на верхней панели программы (рис. 6, значок 1).

6.3.3. Получение хроматограмм для калибровочных растворов.
В хроматографический шприц отбирается калибровочный раствор из виалы в объеме 100 мкл. Ручка переключения потоков инжектора устанавливается в положение «LOAD» (рис. 7). С помощью шприца производится загрузка образца в петлю инжектора. Ручка переключения потоков инжектора переводится в положение «INJECT». Одновременно с этим автоматически начинается запись хроматограммы. Вид хроматограммы на пример разделения ионов калия и натрия представлен на рис. 10. Время анализа составляет 20 мин.
	
Рисунок 10. Хроматограмма разделения ионов калия и натрия.	
По завершении анализа в паспорте хроматограммы (вызов диалогового окна осуществляется нажатием значка на верхней панели программы, рис. 6, значок 2) указывается название пробы и устанавливается флажок «Градуировочная» (рис. 8). Далее, разметив пик катиона, в окне хроматограммы вводят название пробы в графе «Компонент» и вводят в графе «Концентрация» значение содержания катиона в калибровочном растворе. Далее добавляют хроматограмму в калибровочную зависимость с использованием метода расчета - абсолютная градуировка. Градуировку выполняют по 4 приготовленным водным растворам с известной концентрацией катиона. В процессе градуировки хроматографа проводят построение градуировочной зависимости вида  Si = f (Сi),  где Si — площади (или высоты) пиков катиона на хроматограмме; Ci — концентрации катиона в градуировочных растворах.
6.3.4. Получение хроматограммы исследуемого образца. 
Получают у преподавателя контрольный водный раствор, хроматографируют его не менее трех раз. В хроматографический шприц отбирается раствор контрольного образца из виалы в объеме 100 мкл. Ручка переключения потоков инжектора устанавливается в положение «LOAD». С помощью шприца производится загрузка образца в петлю инжектора. Ручка переключения потоков инжектора переводится в положение «INJECT». Одновременно с этим автоматически начинается запись хроматограммы. Время анализа 20 мин. По завершении анализа в паспорте хроматограммы указывается название пробы. Флажок «Градуировочная» не устанавливается. Проводят разметку пика катиона в окне хроматограммы.
Результат  измерений  – концентрация катиона в проанализированном  контрольном образце  (Сизм)  автоматически рассчитывается программной  системой сбора и обработки хроматографической информации «Хромос»,  используя полученный градуировочный график. Получив у преподавателя  сведения о концентрации катиона в растворе (Сист), рассчитывают  относительную погрешность анализа по выражению: Δс=100[Сизм – Сист]/Сист.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
	
1.	Какой вид взаимодействия между компонентами анализируемой  смеси и сорбентом вносит основной вклад в удерживание в случае ионообменной хроматографии? 
2.	За счет чего достигается сохранение электронейтральности ионообменного сорбента с привитыми заряженными группами?
3.	Какие вещества вступают в конкуренцию за взаимодействие с привитой заряженной группой сорбента? 
4.	В каком порядке будут выходить из катионообменной колонки следующие типы веществ: катионы, вещества с выраженными основными свойствами, неполярные компоненты смеси?
5.	Какие вторичные взаимодействия чаще всего протекают при ионообменном процессе?
6.	Какими свойствами элюента определяется удерживание в ионной хроматографии?
7.	В случае разделения каких объектов целесообразно использовать градиентное элюирование в ионообменной хроматографии?
8.	С чем связана необходимость подавления элюента в ионной хроматографии?
9.	В каком месте хроматографического тракта размещается подавительная колонка?
10.	 Каким образом ведут себя при изменении pH среды сильные и слабые ионообменники?
11.	 Какими преимуществами и недостатками обладают ионообменные сорбенты на основе силикагеля и полимерных материалов?
12.	 Как изменяется обменная емкость слабого анионообменника при увеличении pH среды?

СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1.	Стыскин Е.Л. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография / Е.Л. Стыскин, Л.Б. Ициксон, Е.В. Брауде – М.: Химия, – 1986. – 284 с.
2.	Meyer V.R. Practical High-Performance Liquid Chromatography. 5th Edition / Veronika R. Meyer. A JOHN WILEY & SONS, INC. – 2010. – 412 pp.
3.	Фритц Дж., Гьерде Д., Поланд К.М. Ионная хроматография. М.: Мир, 1984. 224с.
4.	Шаповалова Е.Н., Пирогов А.В. Хроматографические методы анализа. Методическое пособие для специального курса. М.: Изд-во МГУ, 2007. 204с.
5.	Орлов В.И., Аратсков А.А. Теоретические основы ВЭЖХ. Дзержинск: Научно-техническая компания "Синтеко", 1997. 41с.
6.	Супрядкина Н.Я., Демина Л.А. Количественный хроматографический анализ. Учебно-методическое пособие. – Дзержинск: ННГУ, 2017. – 41 с.

Денис Михайлович Каморин

ИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Учебно-методическое пособие

Федеральное   государственное  автономное  образовательное  учреждение   высшего образования «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»
Дзержинский филиал ННГУ
606000, Нижегородская обл., г. Дзержинск, пер. Жуковского, д.2